小分子化合物pull down实验技术介绍

小分子化合物pull down实验技术介绍

一、技术概述

小分子化合物Pull-down实验是一种基于亲和层析的分子互作研究技术，通过将小分子化合物共价偶联至固相载体（如磁珠、琼脂糖微球），从复杂生物样本（如细胞裂解液、组织提取物）中特异性捕获与其结合的靶蛋白，结合质谱（MS）或Western Blot（WB）进行鉴定与分析。该技术广泛应用于药物靶点发现、毒性机制研究及信号通路解析，为小分子药物的开发与优化提供关键数据支持。  

二、实验目的

本实验采用生物素标记的化合物，钓取细胞中与该化合物相互作用的蛋白（靶蛋白），再结合质谱或WB实验进行验证。

三、实验流程

1、生物素标记目标化合物（客户提供标记好的化合物）

2、链霉素亲和磁珠与生物素标记的化合物结合

1. 颠倒混匀磁珠，并转移30ul磁珠到一个新的EP管中
2. 将EP管置于磁力架上静置约1min，进行磁性分离；
3. 吸除上清，并加入60ul A液重悬磁珠，然后进行磁性分离；
4. 吸除上清，并加入30ul B液重悬磁珠，然后进行磁性分离;
5. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;
6. 重复步骤5；
7. 吸除上清，并加入30ul 1X 生物素 Capture Buffer重悬磁珠;
8. 加入50pmol 生物素标记的化合物，并吹打混匀；
9. 室温旋转孵育30min

3、样本前处理

1. 用1ml 4℃的RLN 悬浮细胞,冰上孵育５min;
2. 1450 ×g, 4 ℃ 离心２min，去上清；
3. 用100ul预冷的RLN洗涤１次（不能悬浮沉淀）；
4. 用100ul预冷的protein lysis buffer重新悬浮细胞（超声2s停4s；10次）；然后涡旋30s，并吹打混匀；
5. 冰上孵育30min；
6. 17000×g, 4℃，离心15min；
7. 转移上清到一个新的EP管备用。

1. 磁珠复合物与蛋白结合

1. 把预处理好的磁珠，放置到磁力架上进行磁性分离；
2. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;
3. 重复步骤2；
4. 吸除上清，加入100µL of 1X Protein-化合物 Binding Buffer 重悬磁珠；
5. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
6. 吸除上清，并加入100ul 按下表配制的反应体系的mix重悬磁珠：
7. 4℃旋转孵育30min；

5、洗涤与洗脱

1. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
2. 吸除上清，加入100µL 1X wash buffer重悬磁珠；
3. 重复步骤1与2两次；
4. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
5. 吸除上清，加入50ul Elution buffer,重悬磁珠；
6. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
7. 转移上清到新的EP管中，即为pull down 产物；
8. 向 pull down产物中加入13ul loading buffer,并于沸水中水浴10min。
9. 产物进行后续质谱检测

四、技术优势

✅ 高特异性

✅ 广泛适用性

✅ 高灵敏度

✅ 多维度分析  

• 适用范围

1️⃣ 药物研发

2️⃣ 信号通路解析

3️⃣ 天然产物功能研究

4️⃣ 环境毒物靶标鉴定

六、代表性实验结果