miRNA pull down实验技术介绍

miRNA pull down实验技术介绍

一、技术概述

miRNA Pull-down是一种基于生物素标记探针的高效技术，用于捕获与目标miRNA直接结合的蛋白质或RNA分子。通过设计特异性miRNA探针并结合亲和层析（如链霉亲和素磁珠），可全面解析miRNA的相互作用网络，揭示其在基因调控、疾病发生及治疗中的分子机制。  

二、实验目的

通过将本实验结合质谱（MS）或测序技术，本实验能够精准鉴定miRNA的结合蛋白、靶mRNA或竞争性内源RNA（ceRNA），为功能研究与转化医学提供关键数据支持。三、实验流程

（一）探针准备

探针合成：合成生物素标记的miRNA作为pull down的探针

探针序列如下：

（二）miRNA pull down实验

1、细胞培养并转染生物素标记的miRNA

1. 按每皿1×10^7 细胞量培养细胞；
2. 实验组转染生物素标记的 miRNA 探针；
3. 培养48小时后，胰酶消化收集细胞，并用预冷的PBS 洗涤细胞两次；

2、链霉素亲和磁珠与生物素标记的RNA结合

1. 颠倒混匀磁珠，并转移30ul磁珠到一个新的EP管中
2. 将EP管置于磁力架上静置约1min，进行磁性分离；
3. 吸除上清，并加入60ul A液重悬磁珠，然后进行磁性分离；
4. 吸除上清，并加入30ul B液重悬磁珠，然后进行磁性分离;
5. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;
6. 重复步骤5；

3、样本前处理

1. 用500ul预冷的lysis buffer（预先加入RNase Inhibitor）重新悬浮细胞；然后涡旋30s，并吹打混匀；
2. 4℃翻转孵育30min；
3. 17000×g, 4℃，离心15min；
4. 转移上清到一个新的EP管备用。
5. 取30ul 作为input,冻存在-80℃备用；取300ul进行后续实验

4、磁珠与miRNA-RNA复合物

1. 把预处理好的磁珠，放置到磁力架上进行磁性分离；
2. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;
3. 重复步骤2；
4. 用300ul 细胞裂解液重悬磁珠；
5. 4℃旋转孵育60min；

5、洗涤与洗脱

1. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
2. 吸除上清，加入300µL 1X wash buffer重悬磁珠；
3. 重复步骤1与2两次；
4. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
5. 吸除上清，加入50ul Elution buffer,重悬磁珠；
6. 把样本放置到磁力架上进行磁性分离；
7. 转移上清到新的EP管中，即为pull down 产物；
8. 向pull down 产物中加入1mL trizol 进行RNA 纯化回收

6、RNA 反转录与定量检测

1. 按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

注意：注意反转录步骤RNA投入量按等体积进行，后续实验稀释及上机检测皆按比例进行。

1. 按如下程序进行反转录：

37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！

1. 定量PCR检测

1） 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2） 冰上配制下表中的反应液

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

四、技术优势

✅ 高特异性

✅ 广泛适用性

✅ 高灵敏度

✅ 多维度分析  

• 适用范围

1️⃣ miRNA功能机制研究

2️⃣ 疾病机制解析

3️⃣ 药物开发与疗效评估

4️⃣ 诊断标志物开发

六、代表性实验结果