RAP实验技术介绍

RAP实验技术介绍

一、技术概述

RAP（RNA亲和纯化）是一种基于生物素标记RNA探针的高效技术，用于特异性富集与目标RNA分子直接结合的蛋白质或其他RNA分子。通过将生物素标记的RNA探针与样本孵育，结合链霉亲和素磁珠捕获RNA-蛋白复合物，结合质谱（MS）或高通量测序（RNA-seq）分析，可全面解析RNA的相互作用网络。该技术广泛应用于非编码RNA功能研究、RNA-蛋白互作机制解析及疾病靶点筛选。

二、实验目的

本实验利用生物素标记的lncRNA HG互补探针组结合lncRNA HG 同时将与其

互作的核酸、蛋白复合物一起沉淀下来；后续通过二代测序或质谱验证捕获到的

核酸或蛋白。

三、实验流程

1. 细胞交联

a. 用1ml PBS重悬细胞；

b. 加28ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，室温翻转孵育10min；

c. 加入10×甘氨酸至终浓度为1×；室温翻转孵育5min，终止交联；

d.  4℃，3000g，离心3min；弃上清液；

e.  用1ml预冷的1X PBS重悬细胞，用3000g，4℃，5min离心，去上清。

f． 重复e步骤一遍（此步骤沉淀可冻存于-80℃）；

2. 细胞裂解及去除基因组

a. 用800ul lysis Buffer(使用前加入2ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂;4ulRNase Inhibitor)重悬细胞；冰上充分裂解10min；

b. 加入20 ulD DNase、9ul RNA Digest Buffer;常温37℃孵育10min;

c. 将样本转移到冰上，并加入45ul stop solution;

3. 探针准备

a.  用DEPC处理水溶解探针；

b.  混合探针组，使探针组终浓度为：40 pmol/探针

c.  取4ul探针组到一个新的EP管， 85℃变性 3 分钟后，快速转移至冰浴。

d.  Probe组及Bead组分别加入2倍体积的 Hybridization buffer，加入5uL RNase inhibitor及8ul 蛋白酶抑制剂，65℃温育变性 10 min；加入步骤c已变性好的探针37℃杂交 30 min;

e.  50℃温育变性 5 min，37℃杂交3h；

4. 磁珠准备

a. 颠倒混匀磁珠，并转移30ul磁珠到一个新的EP管中

b. 将EP管置于磁力架上静置约1min，进行磁性分离；

c. 吸除上清，并加入60ul A液重悬磁珠，然后进行磁性分离；

d. 吸除上清，并加入30ul B液重悬磁珠，然后进行磁性分离;

e. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;

f. 重复步骤5；

g. 吸除上清，并用步骤3孵育好的裂解液重悬磁珠，室温翻转孵育30min;

h. 磁性分离，吸除上清；

i. 加入500ul Wash Buffer洗涤磁珠5次；

j. 加入50ul Elution buffer 进行洗脱

k. 产物用于银后续质谱检测或提核酸后进行测序检测

四、技术优势

✅ 高特异性与灵敏度

✅ 灵活性与兼容性

✅ 高通量潜力

✅ 多维度分析  

• 适用范围

1️⃣ 非编码RNA功能解析

2️⃣ 疾病机制与靶点发现

3️⃣ 病毒-宿主互作研究天然产物功能研究

4️⃣ 基础分子机制探索

六、代表性实验结果