【技术应用】以药找靶：非标记法靶标筛选技术全解析

“以药找靶”（靶点垂钓/反向药理学）是现代生物医药领域非常核心的策略。在过去很长一段时间里，新药研发流行“以靶找药”（靶点驱动），即先发现一个致病靶点，再针对它筛选化合物。但这种方法研发周期长、成功率低。但是科学家们发现，通过直接在细胞或动物模型上做实验（表型筛选），经常能找到非常有疗效的活性分子。这些分子虽然有效，但我们根本不知道它是通过攻击哪个靶点来治病的（即机制不明）。“以药找靶”正是为了解决这个痛点而出现的。而且许多已经上市或进入临床试验的药物，除了原本已知的靶点外，往往还存在未被发现的“兼职”靶点（即脱靶效应或多靶点效应）。开发一款全新药物动辄耗时数年、耗资数十亿美元。因此，从现有的药物库中挖掘新价值成为了行业的巨大趋势。利用“以药找靶”技术，科学家可以把这些老药当作探针，去钓取新的蛋白质靶点。一旦钓到新的相关靶点，意味着这款老药可能可以用来治疗全新的疾病（如著名的阿司匹林、二甲双胍等）。另外，药物在临床试验阶段失败，很大一部分原因是因为未知的毒副作用。化合物进入人体后，可能不仅结合了治疗病症的靶点，还悄悄结合了其他影响健康的蛋白质。在研发早期阶段使用“以药找靶”，可以在全蛋白质组范围内寻找该化合物还会与哪些非靶标蛋白结合，从而提前预测并规避药物的毒副作用。

由于很多药物一旦被改造就会失效，科学家开发了无需修饰药物寻找靶点的技术，利用药物结合后蛋白质物理性质的改变来揪出靶点。接下来就介绍几种非标记法的“以药找靶”技术。

01 药物亲和反应靶点稳定性技术（Drug Affinity Responsive Target Stability, DARTS）

药物亲和反应靶点稳定性技术是现代“以药找靶”（靶点垂钓）领域中非常经典且高效的非修饰型（Label-free）实验技术。蛋白质在未结合药物时结构较松散，容易被“蛋白酶”像剪刀一样剪碎。但当药物分子与靶蛋白紧密结合后，靶蛋白结构会变得紧实、稳定，从而能够抵抗蛋白酶的切割。通过对比加药和不加药的蛋白被降解程度，就能找出靶点。这种方法完全不需要对药物进行任何修饰。既适合单体化合物，也适合成分复杂的中药复方。

研究案例

研究者为了探究ACA诱导自噬并缓解代谢相关脂肪肝（MAFLD）的机制，作者采用了一种无标记靶蛋白鉴定方法——药物亲和力响应性靶点稳定性分析法（DARTS），并结合液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）。

从3T3-L1脂肪细胞中分离出膜蛋白和胞质蛋白组分。每个蛋白样品分别用对照或ACA处理，随后进行胰蛋白酶消化。接着进行TMT标记和LC-MS/MS分析，以鉴定并定量样品中的蛋白质组。LC-MS/MS分析显示在ACA处理样品中与对照组相比，在检测到的2,614种膜蛋白中，有18种候选蛋白其序列覆盖度增加了超过15%。这种序列覆盖度的增加表明这些蛋白对胰蛋白酶消化具有更强的抵抗能力（图1 A,B）。通过STRING分析，作者探索了这些候选靶蛋白与其配体之间的网络关系，发现该网络主要与MTORC1信号通路、胆固醇摄取调控以及细胞对氨基酸刺激的反应相关（图1 C）。

LAMTOR蛋白是调控MTORC1信号传导的关键蛋白。根据DARTS LC-MS/MS分析，ACA与LAMTOR1和LAMTOR5均结合，其中LAMTOR1（log2 fold change of 0.35）对胰蛋白酶降解的耐受性高于LAMTOR5（log2 fold change of 0.24）。这表明ACA对LAMTOR1的稳定作用比对LAMTOR5更有效。

我们通过DARTS Western blot验证确认，ACA与LAMTOR1结合，并增强了其对蛋白酶降解的稳定性（图1 D、E）。LAMTOR1与ACA之间的结合亲和力呈剂量依赖性增加，EC50值约为44 µM（图1 F、G）。

图1 通过DARTS LC-MS/MS分析鉴定阿卡西汀的药理靶点 (Jang et al., 2025)

02 细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）

蛋白质加热到一定温度就会像鸡蛋清一样变性沉淀。但是，当蛋白质结合了药物小分子后，它的热稳定性大多会增高，需要在更高的温度下才会变性。通过检测不同温度下可溶性蛋白的比例变化来寻找靶点。这种技术可以在完整的活细胞内直接进行，最接近真实的药物体内环境。TPP则是在此基础上结合了多重定量质谱，可实现全蛋白质组的高通量检测。一次实验可以同时监测细胞内几千甚至上万种蛋白质的热稳定性变化。它不仅能钓到药物真正的治疗靶点，还能顺便看清药物还结合了哪些不该结合的蛋白（即脱靶位点），从而解释药物的毒副作用机理。

研究案例

作者利用CETSA方法检测拟南芥蛋白，并使用50 µM的bikinin作为细胞培养中诱导BR (brassinosteroid) 响应的浓度。简而言之，在分别加热25、30、35、40、45、50、55、60、70和80°C，并进行冻融循环后，样品经纳米液相色谱联用串联质谱（nano LC-MS/MS）分析，随后用胰蛋白酶水解，并以10-plex串联质子标记（TMT10）进行标记。

共鉴定出6000种蛋白质，其中在同时处理bikinin和DMSO的样本中，有4225种蛋白质的熔解曲线已确定。约96%的鉴定蛋白质熔解温度位于35°C至60°C范围内（图2A），其中仅有61种蛋白质在50 µM bikinin存在下表现出热稳定性显著变化（27种稳定，34种不稳定），且Tm变化的绝对值≥2°C，基于方差分析[ANOVA]的F检验P < 0.01（图2B）。

由于直接小分子靶点下游效应蛋白的热稳定性变化也被观察到，这可能是由于翻译后修饰改变或与其他蛋白质相互作用所致，作者进一步研究了61种蛋白质（P < 0.01）中是否与AtSKs共同发挥作用。通过STRING数据库检查了这61种具有显著Tm变化的蛋白质中是否有潜在的AtSK互作蛋白。根据该分析，HOPW1-1-INTERACTING2（WIN2，AT4G31750）（Tm变化 = 7.800 °C，P < 0.01）（图2C）被选为可能与AtSK相互作用的蛋白。通过使用烟草（Nicotiana tabacum）细胞瞬时过表达这些蛋白进行共免疫沉淀实验，观察到HA标记的WIN2与AtSK之间的相互作用（图2D）。总之，在细胞悬浮培养中，bikinin影响了拟南芥蛋白组的热稳定性，并导致多种蛋白质的Tm值发生变化，这些蛋白质可能是与AtSK相互作用或AtSK下游效应蛋白的候选物。

图2 拟南芥细胞中Bikinin的CETSA MS分析 (Lu et al., 2022)

03 有限蛋白酶解-质谱法（Limited Proteolysis–Mass Spectrometry, LiP-MS）

有限蛋白酶解-质谱法其核心原理是在不对小分子药物进行任何化学修饰的前提下，通过药物结合引起的蛋白构象变化来实现靶标识别。该方法利用温和条件下的有限蛋白酶解，使蛋白质在不同构象状态下产生差异化的切割模式；当药物与靶蛋白结合后，会改变蛋白局部结构的暴露程度，从而导致蛋白酶切位点的可及性发生变化。随后通过质谱对肽段进行系统性定量分析，即可在全蛋白组范围内识别出具有显著构象差异的候选靶蛋白及其结构变化区域。

研究案例

在天然（非变性）状态的细胞裂解液中，加入低浓度、低特异性的蛋白酶（如 Proteinase K）。这种酶切反应只持续很短的时间。蛋白酶只能切割那些暴露在蛋白质表面、结构柔性较大（Flexible）的特定位点，而包裹在内部的紧密结构域则被保护下来。如果此时蛋白质由于结合了药物分子而改变了构象，其表面的酶切位点就会发生改变。反应结束后，立刻加入变性剂终止反应。随后，使用高特异性的胰蛋白酶（Trypsin）进行常规的完全酶切，将所有蛋白彻底打碎成肽段，利用液质联用（LC-MS/MS）对肽段进行定量分析。如果某个蛋白质在“加药前后”结构发生了变化，那么经过两轮酶切后，质谱检测到的特定半特异性肽段（Fully or Semi-tryptic peptides）的丰度就会发生显著改变。通过追踪这些肽段，就能以氨基酸级别的分辨率精确定位出蛋白质的构象变化区域或药物结合位点。

肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC）中存在一类具有高致瘤能力和耐药性的细胞亚群——Tumor-repopulating cells（TRCs）。这类细胞具有强增殖能力、较强干性以及较高的转移潜能，是导致肿瘤复发的重要来源。研究发现，一种合成视黄酸类似物 Sulfarotene(SFT) 对“肿瘤再生能力强的细胞群”具有特异性作用。作者以Sulfarotene对TRCs的选择性抑制这一明确表型为起点，随后在不对药物进行任何化学修饰的前提下，引入 LiP-MS 在全蛋白组范围内捕捉“药物诱导的蛋白构象变化图谱”。通过有限蛋白酶解产生的差异肽段模式，系统识别出在药物处理后发生结构暴露或折叠状态改变的候选蛋白群，研究进一步对这些构象显著变化的蛋白进行功能富集与通路映射，最终将信号收敛到与细胞骨架重塑及膜蛋白糖基化相关的调控网络，尤其是 P-selectin/PSGL1 的 N-糖基化轴。证实SFT通过诱导RARα入核，抑制P-selectin蛋白表达,并直接结合FUT8抑制P-selectin蛋白配体PSGL1的岩藻糖基化，最终导致细胞骨架受损，诱发ICC的肿瘤再生细胞凋亡。

图3 Lip-MS筛选SFT的靶蛋白（Du X, et al., 2025）

04 表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）靶点垂钓

表面等离子共振靶点垂钓技术是近年来在光学物理学基础上发展起来的一种无标记（Label-free）、实时、动态的生物分子相互作用检测技术。如果说 CETSA 是利用“温度变性”来找靶点，那么 SPR 就是利用“光反射角度的变化”来捕捉小分子与靶蛋白的接触瞬间。首先将药物共价固定在芯片上，当一束偏振光以一定角度照射到芯片时，会激发起表面等离子共振，导致反射光在某个特定角度出现强度的极小值（这个角度叫 SPR 角）。如果细胞裂解液中有某种靶蛋白能与芯片上的药物分子特异性结合，芯片表面的质量就会增加，导致 SPR 反射角发生偏移。实时监测裂解液中不同浓度蛋白与药物的结合与解离过程，结合完成后，用特定的洗脱液将这些被扣留的靶蛋白洗脱下来，直接送入质谱（MS）进行鉴定。这种技术靶蛋白不需要荧光标记，不需要放射性同位素，维持了蛋白质最天然的结构和状态。而且它是极少数能够活着看到药物与蛋白结合全过程的技术。它不仅能告诉你“有没有结合”，还能精确测出结合的速度有多快。即使靶蛋白在复杂的生物样品中含量很低（丰度低），只要它与药物有较强的结合力，引起的微小光学变化也能被系统捕捉到。

研究案例

反义寡核苷酸（ASO）是一类通过沃森-克里克碱基配对与靶mRNA特异性结合来调控基因表达的核酸治疗药物。近年来，多种ASO疗法已获批准，例如米波美赛和伊诺替赛，确立了ASO在临床应用中的地位。在生理条件下，许多靶标RNA会形成高阶结构，这会对ASO的可及性和结合行为产生显著影响。尽管紫外熔解分析被广泛用于评估ASO/RNA双链的热稳定性，但该方法未能充分考虑靶标RNA的结构特征。

在本研究中，作者以表面等离子体共振（SPR）分析法作为评估ASO与结构化靶标RNA结合行为的方法。作为形成茎环结构的模型序列，作者选择了在HIV-1 gag-pol区域诱导−1程序性核糖体移位（PRF）的RNA基序。作者设计了多种针对该靶点的ASO，通过SPR分析其相互作用，并将其与互补RNA短片段所表现出的相互作用进行比较。作者通过 SPR 分析了每种ASO与其互补RNA片段之间的相互作用。在所测试的实验条件下，所有ASO均表现出与对应互补RNA片段的结合反应。结果表明，相同的ASO在靶标为互补RNA时表现出不同的结合行为，说明RNA结构对ASO的结合具有显著影响 (图3)。

图4 ASO与互补RNA片段结合的PR传感器图谱（Shinozaki et al., 2026）

非标记法靶标筛选的核心优势在于无需对候选小分子进行化学标记或结构修饰，从而避免因荧光基团、亲和标签或连接臂引入所导致的空间位阻、理化性质改变以及潜在生物活性偏移，使得药物分子能够以更接近天然状态的形式参与细胞内真实作用过程。这一特点显著提升了靶标识别结果的生理相关性与可靠性，减少了因“标记伪影”造成的假阳性或假阴性干扰。

在机制层面，非标记法通常通过捕捉药物与蛋白结合后引发的下游物理化学变化来实现靶标解析，例如蛋白热稳定性变化（CETSA）反映药物结合导致的构象稳定化或去稳定化，蛋白酶敏感性变化（DARTS）体现结合后蛋白结构暴露程度的改变，以及基于质谱的化学蛋白质组学方法实现全局范围内结合蛋白的富集与鉴定。这些策略共同构建了从“结合事件”到“可检测信号”的间接映射路径，从而在复杂细胞或组织背景中实现系统性靶点筛选。

在应用层面，该类方法特别适用于作用机制尚未明确的候选药物解析、天然产物活性成分的靶点发现，以及早期药物筛选阶段的作用通路鉴定。相比传统标记探针策略，其更适用于结构复杂、修饰空间有限或对结构敏感性较高的小分子体系，有助于在更接近体内真实环境的条件下还原药物—蛋白相互作用网络。

因此，“以药找靶”的非标记筛选策略已成为当前药物作用机制研究与靶点发现领域的重要技术路线之一，不仅提高了靶点鉴定的准确性与覆盖范围，也为新靶点挖掘和创新药物开发提供了更具转化潜力的技术支撑。

参考文献

Jang Y, Ko M, Lee JY, Kim JY, Lee EW, Kwon HJ. Inhibition of lysosomal LAMTOR1 increases autophagy by suppressing the MTORC1 pathway to ameliorate lipid accumulations in MAFLD. Autophagy. 2025 Dec;21(12):2633-2649.

Lu Q, Zhang Y, Hellner J, Giannini C, Xu X, Pauwels J, Ma Q, Dejonghe W, Han H, Van de Cotte B, Impens F, Gevaert K, De Smet I, Friml J, Molina DM, Russinova E. Proteome-wide cellular thermal shift assay reveals unexpected cross-talk between brassinosteroid and auxin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Mar 15;119(11):e2118220119.

Du X, Qi Z, Chen S, et al. Synthetic Retinoid Sulfarotene Selectively Inhibits Tumor-Repopulating Cells of Intrahepatic Cholangiocarcinoma via Disrupting Cytoskeleton by P-Selectin/PSGL1 N-Glycosylation Blockage [J]. Adv Sci (Weinh), 2025. 12(3): e2407519.

Shinozaki T, Hasegawa T, Akter MT, Kumagai K, Suzuki Y, Sakamoto T. Surface Plasmon Resonance Analysis for Evaluating ASO Targeting Structured RNA. Methods Protoc. 2026 Mar 15;9(2):48.