诺禾--实验篇之荧光定量 PCR（上）

首先，我们还是要一同温习一下何为荧光定量 PCR。荧光定量 PCR ( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR ）是一种定量实验技术，经过荧光染料或荧光标志的特异性的探针，对 PCR 产物停止标志跟踪，实时在线监控反响过程，分离相应的软件能够对产物停止剖析，计算待测样品模板的初始浓度。

概念十分浅显易懂，但是科研道路上还是有许多无法跳过的关卡，曾让小编夜不能眠、食不下咽，借此小编将实验中遇到的问题停止了记载和整理，共享给大家。

Q：要把 qPCR 实验做，统共分几步？
A：三步！
Q：哪三步？
A：前期准备、中期操作、后期剖析！

第三步会在下一专题和大家分享，今天先聊聊前两步：

一、qPCR 实验前期准备
前期准备主要是提取、反转录和引物设计局部，我们来逐一分享。

1. RNA 提取留意事项
   首先理解一下，RNA 抽提准绳：保证 RNA 的一级构造、无其它物质的污染、得率高、掩盖一切转录本。再比拟一下 Trizol 提取和试剂盒提取，Trizol 提取相对来说耗时长、含有害化学物质、纯度低、RNA 完好度不高；而试剂盒提取的优点是效率高、纯度高、完好度高，各位可依据实践科研状况选择操作办法。

RNA 提取留意事项：
① 运用无 RNase 的塑料制品和枪头，玻璃器皿要消毒，防止穿插污染；运用性能较好的移液器，如 Eppendorf、Thermo 等；
② DEPC 有剧毒，当心配制；配制溶液应运用无 RNase 的水；
③ 操作人员应戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套；
④ 样品应防止重复冻融，否则影响提取 RNA 提获得率和质量；
⑤ 若下游实验对 DNA 十分敏感，可用不含 RNase 的 DNase I 对 RNA 停止处置。

2. 反转录留意事项
   秉承防止 RNA 被污染和降解的准绳，依照产品阐明书停止即可，细致实验操作以及留意事项可参照之前已推出文章👉 干货 | 实验篇之RT-PCR，此文对反转录过程的引物设计和留意事项给出了较明白的