工程化骨形态发生蛋白的应用

第4章 用于硬组织工程的工程化骨形态发生蛋白

1. 引言

表面特性在确定生物材料对组织的响应方面至关重要。我们研究了生长因子蛋白的固定化，以向细胞提供一组非常强大的信号。与可溶性生长因子相比，固定化生长因子能够更长时间地刺激培养细胞，更有效地促进细胞生长，并诱导细胞分化。通过将固定化生长因子在基底上进行微图案化，展示了其效应。

最近，我们将固定化方法从化学方法扩展到了生物方法。这是用于合成结合生长因子的蛋白质工程。一些携带从纤连蛋白中提取的胶原结合序列的生长因子已被合成。对于硬组织，已选择并改造了骨形态发生蛋白（BMPs）。

骨形态发生蛋白（BMPs）是成骨诱导性生长因子，能够诱导骨形成。它们已被广泛应用于组织工程中以修复骨损伤和骨缺损。BMP家族中的一个蛋白BMP4已被证明是诱导成骨细胞和成骨祖细胞成骨分化并促进骨形成的吸引性因子之一。BMPs通常通过直接注射方式递送，或从支架中释放。提高其结合亲和力或在支架上的固定化已成为一种受到广泛关注的新方法。

这里，我们将讨论结合型BMP的制备方法，并展示结合型BMP在体内实验中的应用。

2. 结合型BMPs的制备

我们制备了两种类型的结合型BMP，一种是通过使用重组DNA技术的传统蛋白质工程方法制备的，另一种是如图2所示的生物正交方法制备的。

2.1. 胶原结合型BMP

源自纤连蛋白的胶原结合结构域（CBD）已证明可延长生长因子在损伤部位的滞留时间，从而增强其活性。因此，将CBD与BMP4连接，以提高BMP4与含胶原蛋白支架的结合能力，实现固定化，同时保持其高生物活性。

编码融合蛋白的基因制备如下：通过胎盘总RNA的反转录聚合酶链反应获得编码成熟BMP4蛋白的人cDNA序列，同时分离出编码纤连蛋白CBD（氨基酸260至599）的DNA片段，将DNA序列进行连接，并将融合基因（CBD‐BMP4）克隆至质粒中。

随后构建了用于将融合基因导入家蚕的质粒。该质粒被注射到家蚕卵中，获得转基因家蚕。筛选携带CBD‐BMP4的家蚕，利用其产生的蚕茧纯化重组CBD‐BMP4。将粉末状蚕茧悬浮于水溶液中，经尼龙网过滤后，提取物进行透析。透析液通过离心澄清并进一步纯化。

2.2. 人工材料结合型BMP

另一种结合生长因子是通过与由非经典氨基酸（如磷酸化丝氨酸（pSpS））组成的水下粘附蛋白的结合基序组合而设计的，来自唾液中的稳定蛋白和贻贝蛋白中的3,4‐二羟基苯丙氨酸，用于与金属和陶瓷等无机材料结合。

利用分选酶将携带磷酸化丝氨酸的肽与骨形态发生蛋白（BMPs）进行偶联，以增强其对羟基磷灰石（HA）的结合亲和力。HA因其成分与天然骨相似，被广泛用作骨植入材料。另一方面，研究表明唾液腺蛋白statherin对HA具有亲和性。已有报道通过化学合成的方法制备了源自该蛋白的短肽，其中磷酸化丝氨酸是产生亲和性的关键。因此，认为可通过将这些非经典氨基酸引入BMP中，从而制备出羟基磷灰石结合型骨形态发生蛋白（图3a）。

为了将非经典氨基酸引入蛋白质，我们采用了分选酶A，它是一种由Staphy-lococcus aureus产生的转肽酶，用于将细胞表面蛋白锚定到细胞壁上。

识别一条多肽C端的LPXTG氨基酸短序列基序和另一条多肽N端的GG序列。分选酶A交换甘氨酸的每一端。

用于编码麦芽糖结合蛋白(MBP)的质粒载体编码序列被用于构建含有分选酶A识别序列的MBP和hBMP4融合蛋白的表达载体。通过人胎盘总RNA的反转录聚合酶链反应获得了编码成熟人BMP4蛋白的DNA序列。在确认DNA序列后，将表达载体导入E. coli，转化后的E. coli在LB培养基中进行培养。重组融合蛋白的表达与纯化按照pMAL系统的标准操作流程进行。

通过固相肽合成法合成了含有两个pSpSs的肽。通过三个甘氨酸与His标签序列，制备了肽GGGpSpSH6。将融合蛋白和肽的混合物在4◦C下孵育过夜，以交换它们之间的末端甘氨酸。这导致融合蛋白与含有pSpS的合成肽发生连接。连接后，融合蛋白用活化的凝血因子X消化。消化后，带有连接肽的剩余BMP4片段（hBMP4‐pSpS）自发沉淀。沉淀物用CaCl2溶液洗涤，并溶于尿素溶液中，然后透析。最后利用添加肽中的His标签对hBMP4‐pSpS进行纯化。

hBMP4‐pSpS在各检测浓度下结合到羟基磷灰石（HA）上的量均显著高于hBMP4‐SS（图3b）。二磷酸丝氨酸（di‐pSpS）是导致hBMP4‐pSpS对HA结合能力增强的原因。

培养1周后，检测了在BMP结合的HA上培养的10T1/2细胞中骨钙素和骨桥蛋白mRNA的表达水平。与hBMP4‐SS或无蛋白对照相比，hBMP4‐pSpS显著增强了骨钙素和骨桥蛋白mRNA的表达（图3c）。这种标志物表达的增强表明，hBMP4‐pSpS在结合HA后仍保留了类似天然BMP4的天然活性，且hBMP4‐pSpS结合量的增加促进了细胞的成骨分化。

3. 体内应用BMP结合

一种结合型BMPs，即CBD‐BMP，被直接注射或与某些支架一起植入用于体内评估。

3.1. 直接注射

将CBD‐BMP4直接注射到小鼠膝关节的孔洞中，以研究其对骨再生的影响。使用针头在股骨远端骨干制造骨孔，并通过注射器将CBD‐BMP4、BMP4或CBD注入右侧股骨的髓腔中。

由于胶原蛋白是骨基质的主要成分，我们首先确认了直接注射后CBD‐BMP4的保留情况。荧光标记蛋白进入小鼠股骨髓腔的情况。数据显示，注射后第3天未检测到BMP4，而CBD‐BMP4在第14天后仍可观察到。CBD的滞留情况类似。仅在第14天时，CBD‐BMP4附近出现明显的钙化现象。

通过测量微CT图像评估骨密度（BMD）。CBD‐BMP4中的骨密度（BMD）高于BMP4组。与4周时相比，CBD‐BMP4在8周时的骨密度（BMD）有所增加。BMP4组未发现变化，提示CBD‐BMP4具有持续的成骨活性。这些数据表明，即使不使用支架，单次注射CBD‐BMP4也能增强骨形成。

为了了解髓内注射CBD‐BMP4促进骨生成的分子机制，在治疗注射后4周从股骨中采集骨髓细胞（BMCs），并检测成骨因子的mRNA表达。在CBD‐BMP4组中，成骨细胞相关因子包括碱性磷酸酶（ALP）、骨唾液酸蛋白（BSP）、骨钙素、osterix和Runt相关转录因子2（Runx2）的表达水平均高于其他组，包括BMP4组。

为了进一步增强CBD‐BMP4在体内诱导的成骨作用，我们在无支架的颅骨缺损模型中应用了CBD‐BMP4、BMP4、CBD或载体。BMP4处理组在治疗后第14天显示出新骨形成。显然，CBD‐BMP4处理组的新骨形成多于BMP4组。组织学检查一致显示，在CBD‐BMP4组和BMP4处理组中，均有由一层成骨细胞排列的新骨形成，且在CBD‐BMP4组中更为显著。

CBD‐BMP4处理上调了靶部位所有相关成骨基因的表达，甚至在注射后4周仍然如此，这可能是由于融合蛋白持续的功能性定位所致。CBD‐BMP4刺激了成骨基因和骨生长因子的de novo表达，作用时间更长，并启动了细胞外基质（ECM）的钙化，从而导致骨形成延长。

3.2. 支架植入

CBD‐BMP4与不同的支架结合用于植入。一种是多孔胶原蛋白‐聚乳酸‐羟基乙酸（PLGA）杂化支架，另一种是可见光固化明胶凝胶。

3.2.1. 胶原-PLGA复合支架

胶原‐PLGA复合支架通过在PLGA编织网的孔隙中形成胶原微海绵制备而成。将由聚乙醇酸910（乙醇酸与乳酸90:10共聚物）制成的薇乔编织网浸入含牛I型胶原蛋白的乙酸水溶液中，并在80◦C下冷冻12小时。随后将网状材料在0.2托的真空条件下冷冻干燥24小时，并通过戊二醛蒸气进一步交联处理，即将该网和25%戊二醛水溶液置于密闭容器内在37◦C下放置4小时，使蒸气达到饱和状态。

将胶原‐PLGA复合支架切割并浸入CBD‐BMP4的水溶液中。用磷酸盐缓冲液洗涤后，制备得到BMP4固定的胶原‐PLGA复合支架。

将人骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）接种于该支架中。经过in vitro培养1天后，将细胞/支架复合物以无菌方式皮下植入无胸腺裸鼠背部。

植入体内4周后，细胞持续增殖并分泌细胞外基质，填充支架孔隙，形成均匀致密的复合物。在BMP4固定的胶原‐PLGA复合支架中培养的BMSCs表现出明显的钙阳性沉积。

采用实时RT‐PCR分析BMSCs的成骨分化。在BMP4固定的胶原‐PLGA复合支架中培养的BMSCs，其编码I型胶原蛋白、碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素的基因表达水平高于在胶原‐PLGA复合支架中培养的BMSCs。植入4周后，在BMP4固定的胶原‐PLGA复合支架中培养的细胞中，编码骨桥蛋白和骨钙素的基因表达水平显著高于对照组其他条件。这些结果与冯科萨染色的组织学结果一致，表明BMP4固定的胶原‐PLGA复合支架具有较强的成骨诱导活性。

3.2.2. 可见光固化明胶

我们通过在玫瑰红（RB）存在下用糠基修饰明胶，开发了可见光固化明胶。为了证明这种新型改性明胶（明胶‐FA）的制备及其作为支架在兔骨软骨缺损模型中用于骨软骨修复的有效性，研究了CBD‐BMP。

为了测试在明胶上的结合亲和力，将BMP4和CBD‐BMP4分别悬浮于不同的明胶溶液中，通过可见光进行光交联，随后在磷酸盐缓冲液中培养7天。收集上清液，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量BMP4浓度。BMP4从明胶‐FA水凝胶中迅速释放，而CBD‐BMP4则在水凝胶中保留至少7天。

我们将含有BMP4或CBD‐BMP4的明胶溶液（15% 明胶‐FA 和 0.05% RB）植入骨软骨缺损处，并用可见光照射2分钟。

载有生长因子的明胶‐FA水凝胶促进了软骨修复。特别是，载有CBD‐BMP4的明胶‐FA在12周时显示出缺损区域被类似周围正常透明软骨的组织完全填充。经CBD‐BMP4‐loaded gelatin‐FA处理的缺损部位的修复组织番红O染色强烈，提示修复组织中存在充足的蛋白聚糖。大体与组织学评分显示，CBD‐BMP4比BMP4更能促进软骨修复。明胶‐FA本身对组织修复的效果相比未处理组在12周时也表现出一定改善。

为了探究修复的分子机制，术后4周采集再生组织，并检测了多种软骨形成因子的mRNA表达。SOX9、聚集蛋白聚糖、Col1a1和col2a1在CBD‐BMP4‐明胶‐FA组中的表达水平均高于其他组，包括BMP4组。因此，CBD‐BMP4组更优异的软骨修复效果与软骨形成因子表达的增加相关。

因子。BMP4组在术后4周未能增加这些因子的表达，可能是由于其从水凝胶中流失所致。此外，载有CBD‐BMP4的明胶‐FA促进了软骨下骨修复。

尽管明胶‐FA单独使用以及BMP4‐明胶‐FA在一定程度上均促进了组织修复，但CBD‐BMP4‐明胶‐FA实现了显著改善的骨软骨修复。在此过程中，覆盖缺损区域的明胶‐FA可能增强了再生组织与周围组织之间的整合，从而支持组织修复。CBD‐BMP4‐明胶‐FA加速组织修复的作用似乎基于来自周围组织的浸润细胞所表达的内源性软骨生成因子。SOX9是软骨形成的关键转录因子，可激活增殖的软骨细胞中表达的基因，其中包括关节软骨主要结构成分之一的聚集蛋白聚糖。Col1a1和col2a1编码I型和II型胶原蛋白的主要成分。CBD‐BMP4组中这些基因表达的增加表明，水凝胶中CBD‐BMP4的固定有助于改善组织修复。改性明胶与细胞和胶原结合生长因子结合后，成为一种有前景的组织工程支架，因为易于实现均匀的细胞接种；植入的细胞能够存活并分化；并且带有CBD的生长因子可保留在水凝胶中。

4. 结论

我们制备了两种类型的结合型BMPs，并将胶原蛋白‐结合型BMP用于直接注射和支架修饰。这些系统可能有利于骨软骨损伤的治疗。未来，将利用通过生物正交方法制备的另一种结合型BMP对生物陶瓷或生物金属应用进行修饰。