两个蛋白可能互作，下一步该如何验证？

蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）是细胞生命活动的核心枢纽，参与信号转导、基因表达调控、代谢网络构建等诸多过程。当通过生物信息学预测、文献挖掘或高通量筛选获得“两个蛋白可能互作”的线索后，如何设计一套严谨、分层、互补的实验方案来确证这一互作，并阐明其分子机制，是功能蛋白研究的关键环节。本文基于经典研究范式，提出一套从“生信预判”到“体内外验证”，再到“结构域定位”和“酶-底物关系鉴定”的系统性方案，供研究者参考。

01 前期生信与逻辑预判（奠定验证基础）

在开展湿实验之前，需从多个维度评估互作的可能性，以提高实验成功率并指导后续策略选择。

1.亚细胞定位共定位分析

利用UniProt数据库获取两个蛋白的已知定位信息；若均为未知，可通过DeepLoc进行预测。

若两者预测/已知定位于同一细胞区室（如细胞核、胞质、质膜），则物理上具备互作前提；若定位不同，则需考虑是否存在转运或应激诱导的共定位。如果两个蛋白定位预测在同一个细胞区室内，可用亚细胞定位实验进行验证。

图1免疫荧光分析DJ-1和G3BP蛋白的亚细胞定位（Repici et al., 2019）。

2.互作可能性预测

利用AlphaFold3进行复合物结构预测，观察模型置信度（pTM、ipTM）及界面残基评估互作的可能性大小。

3.表达与功能关联分析

（1）检查两者在相同组织/细胞中的表达谱是否存在相关性。

（2）若一方为激酶、泛素连接酶或磷酸酶，另一方含相应保守基序（如磷酸化位点、泛素化位点），则可推测为“酶-底物”关系，后续需重点验证其蛋白修饰。

02 体内（细胞内）互作验证—天然环境下确证

体内验证强调在活细胞中，维持蛋白天然构象和互作动态，是互作证据链的第一环。体内可采取以下几种方式进行验证。

1 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）

实验目的:验证两个已知蛋白的体内互作。

实验方法：利用特异性抗体捕获诱饵蛋白A及其形成的复合物，通过Western blot检测共沉淀的蛋白B。

案例分析：xiong等人通过外源法Co-IP实验验证MYC与TAF10在MCF7细胞中的互作，构建Flag-MYC和HA-TAF10过表达质粒转染MCF7细胞，然后进行Co-IP实验，用anti-Flag抗体进行富集诱饵蛋白Flag-MYC，然后用标签抗体anti-HA进行WB检测。结果显示实验组Flag-MYC+HA-TAF10中出现了Flag-MYC和HA-TAF10条带，表明两者存在互作。

图2 Co-IP实验验证MYC与TAF10在MCF7细胞中的互作（Xiong et al., 2023）。

2 邻近连接分析（Proximity Ligation Assay, PLA）

实验目的：验证两个蛋白互作及观察互作位置。

实验方法：分别孵育两个目标蛋白的IF一抗，当两个蛋白距离<40 nm时，偶联寡核苷酸的二抗通过连接和滚环扩增产生点状荧光信号，实现单分子水平可视化。

案例分析：Anandhan等人用PLA验证PSD95-NR2B互作及位置，anti-MAP2标记神经元细胞（MAP2是一种丰富的神经元细胞骨架蛋白），HOECHST标记细胞核位置。结果显示PSD95-NR2B存在互作（图中红色荧光点），绿色为MAP2免疫荧光染色，说明PSD95-NR2B在神经元细胞中的互作情况。

图3 PLA结果展示PSD95-NR2B在神经元细胞中的互作情况（Anandhan et al., 2025）。

3 荧光共振能量转移（FRET）

（1）原理：将蛋白A与供体荧光蛋白（如CFP）融合，蛋白B与受体（如YFP）融合，当两者靠近时（<10 nm），供体激发后能量转移至受体，检测受体发射光。

（2）方式：采用激光共聚焦对荧光信号进行采集分析。

（3）注意：需校正光谱串扰，并确保融合荧光标签不影响蛋白定位和功能。

图4 FRET的工作原理（Scolari et al., 2009）。

03 体外（无细胞体系）互作验证—排除中介分子干扰

体外实验使用纯化蛋白，可排除细胞内其他分子的桥接作用，直接证明两蛋白能否物理结合。

1 GST Pull-down

实验目的：验证两个蛋白的体外互作（直接互作）。

实验方法：将蛋白A与GST（谷胱甘肽-S-转移酶）融合表达并固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上，与纯化的蛋白B孵育，洗脱后通过SDS-PAGE/Western检测B是否被捕获。

案例分析：Wang等人用Co-IP和GST Pull-down验证USP21和AURKA的互作，图E结果中GST（阴性对照）泳道无条带，而GST-USP21实验组出现了USP21和AURKA条带，表明两者存在互作

图5 Co-IP和GST Pull-down共同验证USP21和AURKA的互作（Wang et al., 2023）。

2 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）

实验目的：验证两个蛋白的体外互作（检测亲和力大小）。

实验方法：将一种蛋白固定于传感芯片表面，另一蛋白作为流动相流经表面，实时检测结合-解离曲线，获得动力学参数。

案例分析：Zhu等人用SPR测定pCTS-L与TLR4相互作用的亲和力大小，结果表明pCTS-L与TLR4存在直接相互作用，亲和力为24.1nM，属于高亲和力范畴，且一旦结合后解离极慢（半衰期约6分钟），表明这是一对稳固的配体-受体结合对。其中结合速率常数（k_on）= 8.08 × 10⁴ M⁻¹s⁻¹，意味着两者结合时需要发生微弱的构象变化（变构效应），或者两者的结合位点存在一定的空间位阻；解离速率常数（k_off）=1.95 × 10⁻³ s⁻¹表明一旦pCTS-L抓住TLR4，它们在6分钟内都不会分开。这种“慢解离”特性是高稳定性互作的标志，表明两者之间形成了牢固的键合（如氢键、疏水相互作用等多重作用力）。

图6 SPR测定pCTS-L与TLR4相互作用的亲和力（Zhu et al., 2023）。

04 互作结构域鉴定

确定整体互作后，进一步明确“哪个区域负责结合”，对理解功能和设计干预策略至关重要。

截短突变体策略：根据蛋白的已知功能域（如SH2、PDZ、WW、锌指等）单独做结构域之间的互作验证，可选择体内或体外验证。如果蛋白的结构域未知，可通过CD-Search、SMART预测蛋白结构域。

案例分析：Vadnais等人验证GFI1与p53蛋白的互作区域。

（1）首先（图7 A-B图）在293T细胞中过表达GFI1的系列截短突变体（均带Flag-HA标签），用抗Flag抗体进行免疫沉淀（IP），然后通过Western blot检测内源性p53是否被共沉淀。同时检测Input（细胞裂解液）确保各突变体表达水平一致。图B为突变体的结构示意图。

结果(图7 A图）:全长GFI1（WT） 能有效拉下p53（阳性对照）。缺失SNAG结构域（ΔSNAG） 或缺失DNA结合结构域（ΔDBD） 的突变体，仍能与p53结合，说明这两个结构域对互作非必需。缺失中间结构域（ΔID，即intermediary domain） 的突变体，则完全失去与p53的共沉淀能力。

（2）然后（图7 C-D图）在293T细胞中共表达p53的系列截短突变体（带HA标签）和全长GFI1-Flag（无HA），用抗HA抗体进行IP，再检测Flag（即GFI1）是否被共沉淀。图D为p53突变体结构示意图。

结果(图7 C图）:全长p53（含N端和C端）能与GFI1共沉淀。缺失N端（ΔN）的p53突变体仍然结合GFI1，说明N端不参与。缺失C端（ΔC，即去掉C-terminal 24个氨基酸）p53突变体则无法结合GFI1。

（3）最后（图7 F-G图）在IP体系中分别加入溴化乙锭（EtBr） 或苯甲酸酶（benzonase）——前者干扰DNA与蛋白的结合，后者降解DNA——然后检测GFI1与p53的共沉淀是否受影响。

结果(图7 F-G图）:在IP反应中加入EtBr（破坏DNA-蛋白复合物）或benzonase（降解DNA）后，GFI1与p53的共沉淀量未减少，与不加处理的对照无差异。

图7 GFI1与p53蛋白的互作区域验证（Vadnais et al., 2019）。

05 酶-底物关系专项验证（若适用）

当预测一方为酶（激酶、磷酸酶、E3泛素连接酶等），另一方为潜在底物时，可设功能验证以证明催化关系。

以磷酸酶-底物验证为例，可进行如下验证：

（1）细胞内磷酸化水平检测：过表达/敲低磷酸酶，观察底物总磷酸化或特定位点磷酸化变化（结合质谱或WB）。

（2）体外去磷酸化实验：将纯化的底物蛋白与磷酸酶共孵育，用磷酸化特异性抗体或泛磷酸化抗体检测信号,关于体外磷酸化验证具体思路可以查看往期公众号文章“蛋白磷酸化不会做？一文讲透体外磷酸化实验设计与流程”。

（3）突变底物磷酸化位点：可以构建相应底物磷酸化位点的突变体，通过对比底物WT野生型和MUT突变型的体外磷酸化结果，进一步验证磷酸化位点。

案例分析：将纯化的重组TRPML1蛋白作为底物，与重组活化的AKT1激酶在含ATP的激酶缓冲液中于30°C孵育0.5小时。图8 G体外磷酸化实验结果显示AKT1激酶+TRPML1组中出现了p-Ser/Thr条带条带，表明AKT1能直接在TRPML1上催化添加磷酸基团。尤为严谨的是，实验设置了λ-磷酸酶处理组——这种广谱磷酸酶能特异性地切除已连接的磷酸基团，结果磷酸化信号随之消失（p-Ser/Thr条带消失），从而严格排除了非特异性结合或背景干扰，确证了磷酸化修饰的真实性。

研究者将野生型TRPML1（WT）与磷酸化缺失突变体TRPML1-S343A（将第343位丝氨酸突变为丙氨酸，使其无法被磷酸化）进行平行体外激酶反应。图8 I结果显示：野生型组呈现强烈的磷酸化条带，而S343A突变体组的信号几乎完全消失。

图8 体外磷酸化实验验证AKT能磷酸化TRPML1（Zhang et al., 2024）。

06 方案整合与逻辑闭环

一套完整的互作验证方案应遵循“先体内、后体外、再结构、终功能”的递进逻辑：

（1）初筛：Co-IP + PLA（体内）确立互作存在性。

（2）确证：GST Pull-down + SPR（体外）确认直接结合并量化亲和力。

（3）深化：结构域截短，锁定蛋白结合区域。

（4）功能延展：若存在酶-底物关系，则通过体外酶活和体内修饰位点突变完成“底物”身份确认。

所有实验应设置严格对照，结合功能表型实验（如细胞增殖、信号通路活性变化）将互作与生物学意义关联，形成完整证据链。

07 结语

验证两个蛋白互作并非单一实验可完成，而是需要多技术交叉印证、多层次递进推进的系统工程。上述方案从生物信息预判出发，融合经典生化手段（Co-IP、Pull-down）、高敏光学技术（PLA、FRET、SPR）以及结构功能解析策略，既覆盖了“是否互作”，也兼顾了“如何互作”和“为何互作”。研究者在实际应用中，可根据蛋白特性和实验室条件灵活剪裁，但核心原则不变：多种正交方法、正反双向验证、突变体对照、功能与结合联动。唯有如此，才能为后续机制研究和药物靶向干预奠定坚实基础。

参考文献

Anandhan S S S. Quantification and Limitations of PSD95-NR2B Clustering using Proximity Ligation Assay in Primary Neuronal Cultures[J]. 2025.

Repici M, Hassanjani M, Maddison D C, et al. The Parkinson’s disease-linked protein DJ-1 associates with cytoplasmic mRNP granules during stress and neurodegeneration[J]. Molecular neurobiology, 2019, 56(1): 61-77.

Scolari S. Lateral organization of the transmembrane domain and cytoplasmic tail of influenza virus hemagglutinin revealed by time resolved imaging[D]. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I, 2009.

Xiong Y,Wang L, Xu S, et al. Small molecule Z363 co- regulates TAF10 and MYC via the E3 ligaseTRIP12 to suppress tumour growth[J]. Clinical and Translational Medicine, 2023, 13(1): e1153.

Vadnais C, Chen R, Fraszczak J, et al. A novel regulatory circuit between p53 and GFI1 controls induction of apoptosis in T cells[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1): 6304.

Zhu C S, Li J, Wang H. Use of Open Surface Plasmon Resonance (OpenSPR) to Characterize the Binding Affinity of Protein–Protein Interactions[J]. Bio-protocol, 2023, 13(17).