MNase-seq

1. MNase-seq 简介

MNase-seq（Micrococcal Nuclease Sequencing，微球菌核酸酶测序）是一种用于研究 染色质结构 和 核小体定位 的高通量测序技术。它利用 微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease, MNase） 的特性，选择性消化裸露的DNA，而保留核小体（nucleosome）包裹的DNA片段。随后，对这些DNA片段进行测序，以分析染色质的构象、核小体占据位置及其调控作用。

2. MNase-seq 的原理

MNase-seq 的原理主要基于 MNase 对染色质的选择性降解：

1. MNase 是一种核酸内切酶，具有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶活性：

   • 对游离 DNA（无蛋白结合）高度敏感

     ，可完全降解成小片段。

   • 对核小体保护的 DNA 具有较低的降解能力

     ，因此可用于研究染色质结构。

2. 核小体是 DNA 与组蛋白形成的基本单位，每个核小体约由 147 bp DNA 围绕 组蛋白八聚体（H2A、H2B、H3、H4 各两份） 形成。

3. MNase 消化后，核小体保护的 DNA 片段会被富集，并通过高通量测序（NGS）分析核小体的 定位、间隔、占据密度 等信息。

3. MNase-seq 实验流程

(1) 样本制备

• 选择细胞或组织样本（如哺乳动物细胞、酵母、植物等）。

• 交联（可选）：有时会使用 甲醛交联 来稳定染色质结构，特别是在研究动态核小体时。

• 细胞裂解，释放染色质。

(2) 微球菌核酸酶（MNase）消化

• 使用不同浓度的 MNase 处理染色质，以获得不同程度的 DNA 片段化：

  • 短时间消化

    ：保留多核小体片段（如二聚体、三聚体）。

  • 长时间消化

    ：主要获取单个核小体（~147 bp DNA）。

• 终止反应，提取DNA。

(3) DNA 片段纯化

• 使用 酚-氯仿提取 或 磁珠纯化 去除蛋白质等杂质。

• 琼脂糖凝胶电泳

   或 生物分析仪（Bioanalyzer） 检测片段大小（主要分布在 ~147 bp）。

(4) 构建测序文库

• 连接测序接头（Adapter ligation）。

• 选择适当片段大小（~150 bp）。

• 进行 PCR 扩增，富集目的 DNA 片段。

(5) 高通量测序

• 采用 Illumina、Nanopore 或 PacBio 平台进行测序（Illumina 最常用）。

• 生成短读序列（Reads）。

(6) 数据分析

数据分析主要包括：

1. 数据质控（Quality Control, QC）

   • 使用 FastQC 检查测序数据质量。

   • 过滤低质量 reads 和接头污染。

2. 比对到参考基因组

   • 使用 Bowtie2 或 BWA 将 reads 对齐到参考基因组。

   • 过滤多重比对的 reads。