CRISPR-Cas9实验常见问题及解决方案

最新推荐文章于 2025-03-06 00:13:06 发布

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#CRISPR-Cas9实验 #CRISPR-Cas9 #基因敲除

本文探讨了CRISPR-Cas9基因编辑中DNA修复的不同途径，如NHEJ、HDR和MMEJ，强调了它们在编辑效率和精确度上的区别，以及细胞周期对修复的影响。通过深入解析，为实验设计和问题诊断提供指导。

做一件事的解决方案有很多种，不同的方案会有不同的protocol，那又回到源头问题，到底要选择什么方案？遇到问题的时候到底如何解决？

CRISPR-Cas9基因编辑最常遇到的问题就是：没挑到单克隆、编辑不成功/效率。相信包括我在内的很多CRISPR新手，会将更多的重点放在sgRNA的设计、感染/转染、挑单克隆等等方面，一直到最后基因敲除效率还是很低或者根本没成功。
会首先将原因归结在sgRNA的效率不高，因此会选择重来一次。
同时CRISPR-Cas9的名字也非常具有迷惑性，会让我们潜意识的放在CRISPR-Cas9这两个元件上。
然而，CRISPR-Cas9只是前半部分，后半部分则是DNA repair。
这意味着，即使sgRNA效率非常高，一切都很完美，但如果DNA repair出来岔子，一样前功尽弃。
因此，不要忘了DNA repair在基因编辑中的重要作用。
我们在实验设计阶段就要充分考虑课题目的，选择相应的DNA修复方式。

从文献中我们可以看到，在外界损伤的刺激下，例如细胞内活性氧、电离辐射、紫外损伤以及药物干预等等, 细胞能启动 7 条修复通路来分别应对不同类型的损伤：

（1）直接修复 (direct repair, DR) 通路;
（2）碱基切除修复 (base excision repair, BER);
（3）核苷酸切除修复 (nucleotide excision repair, NER);
（4）碱基错配修复 (mismatch repair, MMR) 纠正碱基错配;
（5）同源重组修复 (homologous repair, HR);
（6）非同源的末端连接 (non-homologous end-joining, NHEJ) 通路；
（7）translesion DNA 合成 (translesion DNA synthesis, TLS)；

其中后HR，NHEJ通路专门修复 DN